DNA纯度评估

---

介绍

DNA纯度是指不含任何蛋白质、RNA或其他任何污染物的DNA。即使在DNA提取后，仍然会残留一些杂质，可以使用某些化学物质或酶将其去除。此步骤确保DNA的直接和下游应用的成功。

DNA纯化

使用各种物理和化学方法裂解细胞，以从细胞核中释放DNA。DNA提取后，细胞碎片以蛋白质的形式附着在其上，可以使用蛋白酶去除，或者直接从不纯的DNA样品中过滤掉。

进一步纯化是通过使用异丙醇或乙醇等醇类沉淀DNA来完成的。DNA溶于水，因此无法分离，因此使用乙醇搅拌DNA并使用无菌移液管将其缠绕出来。此后，DNA悬浮在碱性溶液中并使用。

DNA纯化的重要性

• 纯化很重要，因为它确保提取了研究工作所需的相同质粒或基因组DNA。

• 去除DNA中的碎片或污染物可以延长DNA的保存期，并降低研究工作中出现错误的可能性。

DNA纯度评估方法

一般使用三种方法来评估DNA的纯度：

• 吸光度法

• 荧光法

• 凝胶电泳

使用分光光度法的吸光度法

• 这是测试DNA纯度和产量的最可靠方法。吸光度法测定纯度所需的设备包括：具有紫外灯的分光光度计、对紫外光透明的比色皿以及待测DNA样品。

• 由于DNA在260nm波长处强烈吸收光线，因此吸光度读数取为260nm或A260。此波长产生的数值允许估计含有DNA溶液的浓度。

• 仪器中设置的线性范围为0.1到1，用于获得有用的数值。在320nm处测量DNA样品的浊度。

• 样品中DNA的浓度由以下公式给出：

DNA浓度(µg/ml) = (A260 - A320) × 稀释因子 × 50µg/ml

• DNA的产量可以通过浓度和样品体积的乘积来测量。

DNA产量(µg) = DNA浓度 × 样品体积 (ml)

• 但是，这种计算存在局限性，不仅DNA，RNA也能在260nm处吸收紫外光。一些芳香族氨基酸，如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，也能在280nm处吸收紫外光，而胍在260nm处也有很高的吸收。由于所有这些原因，有时产量会被高估。

• 为了克服这一局限性，通过测试230nm到320nm的纯度来测试杂质的存在。最常用的纯度计算是通过取260nm与280nm的比率来完成的。纯DNA的值为1.7到2.0。低于1.7的值表示存在其他污染物。纯度计算公式如下：

DNA纯度 (A₂₆₀/A₂₈₀) = (A₂₆₀读数 - A₃₂₀读数) ÷ (A₂₈₀读数 - A₃₂₀读数)

• 纯DNA的首选值为大于1.5，小于该值表示浊度。

荧光法

• 与吸光度法相比，荧光法被认为更灵敏，可用于非常低浓度的DNA样品。

• 此方法使用荧光DNA结合染料和称为荧光计的仪器来检查DNA的纯度。与分光光度法相比，这些染料可提供更准确的结果。

• 一些常用的DNA结合荧光染料包括Pico Green、Quantiflour和Hoechst双苯并咪唑，它们特异性地结合到双链DNA上。

• 所使用的荧光计只有一个带有微孔板的试管，样品可以在PCR管、比色皿中读取，这使得它成为检测样品中DNA纯度和浓度的最便捷方法之一。

• 根据所选择的染料，设置激发和发射值，计算未知值的浓度并与已知值进行比较。

• 此方法的唯一局限性是荧光化合物的猝灭和光漂白效应会改变信号。

凝胶电泳

• 另一种用于测试浓度和纯度的方法是琼脂糖凝胶电泳。

• 此方法根据电荷和大小分离DNA。由于DNA带负电荷，它将向带正电的阳极移动，DNA分子越小，移动速度越快。

• 制备琼脂糖凝胶的百分比也决定了可以用其分离的尺寸范围。与以不同速率移动的RNA或蛋白质相比，形成的DNA条带是清晰的。

• 可以通过将DNA条带的强度与标准DNA进行比较来确定浓度，并使用嵌入染料溴化乙锭来观察DNA。

结论

在研究中，在将分离的DNA样品用于分析过程之前，质量指标显示其质量和可用性。这里的质量指标是DNA样品的完整性和纯度。纯度在很大程度上决定了研究的成功；因此，DNA样品应不含任何蛋白质等污染物。