非放射性同位素杂交法

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介绍

多年来，放射性同位素杂交技术一直被用于从混合分子中检测DNA和RNA片段。但放射性同位素杂交技术更危险，因为它会激活癌细胞并损害DNA，从而危害附近人员的健康。

因此，为了避免这个问题，人们一直在寻找更安全的替代方法，研究人员提出了一种相对较新的技术，其中酶标记探针与荧光底物反应生成有色产物。

非放射性杂交

非放射性同位素杂交法通过使用作用于化学发光或显色底物的酶来帮助检测目标DNA片段。这种底物被转化为发光的产物。

这种方法相对安全，因为不使用放射性物质，因此不会产生有害辐射。

非放射性同位素杂交的类型

有两种非放射性同位素杂交方法：

• 直接非放射性方法。

• 间接非放射性方法。

直接非放射性同位素方法

在这种方法中，反应混合物中加入了一种连接到标记基团的核苷酸。标记的基团称为荧光团。荧光团是在暴露于特定波长的光时会发出荧光的基团。

一些常见的荧光团例子包括发出红色光的生物素，发出绿色光的荧光素，发出红色光的罗丹明等等。

间接非放射性同位素方法

• 在这种方法中，报告分子通过化学键与核苷酸结合。标记的报告分子核苷酸自身附着到DNA上。标记分子附着在亲和分子上，亲和分子对报告分子具有非常高的特异性。结合的标记分子可以通过测定来检测，然后添加到反应混合物中。

• 由于亲和分子可以很容易地检测到报告分子，它将与之结合。未结合的分子可以通过洗涤去除。通常使用的亲和分子是抗体或特异性配体。

• 用于检测标记分子的测定方法取决于附着在其上的基团。例如，如果使用特定的荧光染料，则可以使用荧光测定法进行检测；如果酶附着在标记分子上，则使用比色法来识别最终形成的有色产物。

间接非放射性同位素方法的类型

根据所附着或结合的配体，有两种间接系统：

• 生物素-链霉亲和素系统

• 地高辛系统

生物素-链霉亲和素系统

• 在这个系统中，两种配体相互结合；一个是生物素，这是一种常见的维生素；另一个是链霉亲和素或抗生物素蛋白。链霉亲和素是一种细菌蛋白，抗生物素蛋白存在于蛋清中。

• 链霉亲和素作为亲和分子，对作为报告分子的生物素具有高度特异性。

• 首先，核苷酸与作为探针的生物素分子结合。然后将该探针与目标DNA片段杂交。

• 然后将链霉亲和素添加到该混合物中，随后添加与生物素结合的生物素标记酶（一种碱性磷酸酶）。

• 然后添加标记酶的底物，并根据所使用的底物对酶促反应形成的产物进行测定。

• 链霉亲和素具有四个生物素结合位点的独特特性。因此，单个链霉亲和素分子可以同时结合生物素标记探针和生物素标记酶。生物素标记或链霉亲和素结合不会中断酶的活性。

地高辛系统

• 地高辛来源于毛地黄植物，是由这种植物的花和叶产生的甾体。

• 地高辛结合到特异性抗体上，然后用于检测目标核苷酸片段。

• 此处，与地高辛结合的抗体充当亲和分子，而地高辛充当报告分子。

• 首先，核苷酸与地高辛结合，然后将该缀合物与DNA片段杂交。

• 然后加入亲和分子（与地高辛结合的抗体）。现在，通过将碱性磷酸酶与地高辛结合，形成地高辛标记酶。

• 加入底物后，根据所使用的底物，使用比色法或其他技术检测形成的产物。

根据用于信号放大的底物，非放射性同位素方法分为两种类型

• 化学发光法：在这种方法中，使用化学发光底物，该底物在转化为可使用发光计测量的特定产物后会发出光。

• 显色法：在这种方法中，使用显色底物，当合适的酶作用于它时，它会改变颜色。可以使用比色计测量这种颜色变化。

非放射性同位素杂交的优点

• 与放射性同位素方法相比，它们更灵敏。例如，化学发光法非常灵敏，并能产生准确的结果。

• 它们对环境的影响较小，因为不使用生物危害的放射性物质。它们易于处理，不需要特殊的方法。

• 这是一种非常快速的方法，因为可以在程序进行后的几个小时内获得结果。

• 探针更稳定。例如，生物素标记探针在室温下可稳定保存一年以上。

结论

尽管大多数研究实验室都使用放射性同位素杂交技术，该技术涉及将目标DNA结合到固体支持物上，并使用放射性物质作为探针。但是，由于其危险性以及对复杂处置设备的需求，它们已被使用环保底物和探针进行检测的非放射性技术所取代。