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法学P1 衍生人工染色体或 PAC
关键词
P1噬菌体、细菌人工染色体、细菌、DNA克隆载体、DNA片段、大肠杆菌、酵母人工染色体、复杂基因组、基因簇、限制性内切酶、连接、限制性位点。
介绍
P1 衍生人工染色体 (PAC) 是一种来源于 P1 噬菌体和细菌人工染色体的 DNA 结构。它可以携带约 100-300 千碱基对的其他序列，用于细菌中的各种生物工程目的。
它是一种有效的克隆载体，用于克隆大肠杆菌细胞中的 DNA 片段（插入大小 100-300 kb；平均 150 kb）。DNA 克隆载体包含 P1 噬菌体基因组区域，能够接受大型 DNA 插入片段（长 100 千碱基对）。在这个系统中，载体 DNA 和待克隆的 DNA 片段体外连接并包装成噬菌体颗粒，这些噬菌体颗粒可以感染大肠杆菌。
PAC 可用于克隆大型基因、染色体步移、物理作图和复杂基因组的鸟枪法测序。与细菌人工染色体 (BAC) 和酵母人工染色体 (YAC) 相比，PAC 克隆系统将有助于复杂基因组的作图和详细分析。
即使使用 BAC 和 PAC 载体，所需的基因簇有时也可能分布在两个或多个克隆之间。通常需要或希望将这两个片段连接到一个单一的结构中，以便可以很容易地用于异源表达。由于缺乏合适的限制性位点，通常无法通过限制性内切酶消化和连接来实现这一点。
PAC 的历史
P1 噬菌体最初由 Giuseppe Bertani 博士分离。在他的研究中，他注意到溶原菌产生了异常的非连续噬菌体，后来发现除了 P2 和 P3 噬菌体外，P1 噬菌体也是由 Lisbonne 溶原菌株产生的。
P1 可以复制细菌的宿主基因组并将该 DNA 信息整合到其他细菌宿主中，也称为普遍转导。后来，P1 在 20 世纪 90 年代由 Nat Sternberg 及其同事开发为克隆载体。它能够进行 Cre-Lox 重组。P1 载体系统最初是为在质粒中携带相对较大的 DNA 片段 (95-100kb) 而开发的。
构建
PAC 具有 2 个 loxP 位点，噬菌体重组酶可以在 Cre-Lox 重组过程中利用这些位点从其 cre 基因识别形成产物。此过程使 DNA 链环化，形成质粒，然后可以将其插入到诸如大肠杆菌之类的细菌中。
转化通常通过电穿孔进行，电穿孔利用电力使质粒渗透到细胞中。如果需要高表达水平，则可以在构建体中使用 P1 裂解复制子。电穿孔允许 PAC 的溶原性，因此它们可以在不干扰其他染色体的情况下在细胞内复制。
与其他人工染色体的比较
PAC 是人工染色体载体之一。其他一些人工染色体包括细菌人工染色体、酵母人工染色体和人类人工染色体。与其他人工染色体相比，它可以携带相对较大的 DNA 片段，但比酵母人工染色体 (YAC) 要小。
与 YAC 相比，PAC 的一些优点包括：更容易操作细菌系统、更容易与 DNA 宿主分离、更高的转化率、更稳定的插入片段，并且它们是非嵌合的，这意味着它们不会重排和连接形成新的 DNA 链，从而提供了一种用户友好的载体选择。
应用
PAC 通常用作大容量载体，允许在大肠杆菌中繁殖大型 DNA 插入片段。此功能通常用于：
- 构建人类、小鼠等的基因组文库，有助于人类基因组计划等项目。
- 文库作为基因测序的模板（例如：用作小鼠基因功能分析中的基因模板）。
- 对更复杂生物体（植物、动物等）中不同基因的特定功能进行基因组分析。
- 促进基因表达。
由于 PAC 来源于噬菌体，因此 PAC 及其变体也可用于基于 PAC 的噬菌体疗法和抗生素研究。
结论
细菌人工染色体 (BAC) 和 P1 衍生人工染色体 (PAC) 是稳定维持在细菌中的大型基因组克隆，由于其大小和稳定性，在通过转染进行的功能研究中非常重要。因为大多数 BAC 或 PAC 载体不具有哺乳动物选择标记，所以用 BAC 或 PAC 中克隆的基因转染哺乳动物细胞需要将哺乳动物选择标记插入 BAC/PAC 中。
大型基因组测序项目已经提供了许多基因的 DNA 序列信息，但是大多数基因的生物学功能只有通过功能研究才能知道。然而，目前可用的程序在效率和保真度方面并不令人满意。
BAC/PAC 改装载体用于转化成有能力的 BAC 或 PAC 菌株，将通过体内 cre/loxP 位点特异性重组催化其自身特异性插入 BAC/PAC 载体中。
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