微生物发酵：终产物的收获、纯化和回收

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关键词

细胞裂解，细胞壁工程，下游加工，微生物发酵，形态工程，合成生物学。

介绍

微生物发酵是由微生物的生命活动引起的化学变化，不同的微生物引起不同的发酵并产生不同的发酵产物。微生物的发酵不仅仅是制作食物，而是现代大规模生产中的一个工业部门。

这强调了在生产有机饲料和生物肥料中发酵和关键菌株的遗传改良的应用。微生物对酿酒的影响始于葡萄园，并贯穿发酵和葡萄酒的储存或陈酿过程。在生物加工行业，发酵是一个培养微生物以产生产品的单元操作。

发酵完成后，以适合其预期用途的剂型收获、纯化和最终加工发酵产物称为下游加工。下游是一个非常昂贵的微生物发酵过程。

它通常涉及复杂的设备和工艺，以从微生物的细胞内和细胞外空间获得所需的化学物质或材料。下游加工是指回收和纯化发酵产生的产物所需的程序。在下游加工步骤中，主要为细胞的颗粒通过过滤、离心和絮凝从液体中分离出来。

下游加工步骤

下游过程涉及五个主要阶段：将细胞与发酵液分离（固液分离）、分离不纯产物（释放细胞内产物）、浓缩、纯化（色谱）和产品的最终加工（制剂）。发酵产生的产物可以是细胞内或细胞外的，也可以是耐热或敏感的。因此，下游工艺的设计考虑了许多因素，以最低的成本获得纯净的分离产物。

特定工艺的选择取决于以下因素。

• 产物位置：细胞外/细胞内。
• 产物敏感性。
• 产物浓度或可能的产量。
• 产物的特性和用途。
• 可接受的纯度标准。
• 可能的杂质。
• 工艺的经济性和产品的市场价格。

预处理

发酵液含有微生物细胞、细胞碎片、可溶性和不溶性培养基成分以及活性产物。对发酵液进行预处理以改变培养基的粘度、生物质大小以及颗粒之间的相互作用。将合成聚合物、纤维素聚阳离子以及无机盐作为絮凝剂添加到培养基中。这些试剂可导致单个细胞颗粒凝聚成大的絮状物，从而有利于通过离心分离。当产物是细胞内的时，采用一些方法来裂解细胞以释放细胞内产物。

分离

细胞内产物的细胞破坏后和细胞外产物不破坏细胞后的细胞通过离心或过滤分离。过滤保留大的颗粒作为滤饼，并允许液体通过过滤器。液体通过过滤介质的流动取决于过滤器的面积、过滤器的孔径以及滤饼在过滤介质上形成的流动阻力。纤维素、玻璃、陶瓷、合成膜、合成纤维、织物、金属等用作过滤介质。当过滤不是去除微生物的令人满意的方法时，可以使用离心法。不同类型的离心机具有不同的转速。

浓缩

微生物细胞分离后，使用不同的提取、蒸发和沉淀技术对培养基进行分馏或提取。

• 蒸发是一个简单但耗能的过程，主要用于去除水分。降膜蒸发器、强制膜蒸发器、板式蒸发器和离心强制膜蒸发器通常用于浓缩溶剂。

• 在产品回收过程中，进行沉淀以一步富集和浓缩产品。

• 沉淀技术通常用于回收产品以及分离杂质。沉淀是通过外部试剂实现的，例如酸和碱（改变pH值）；有机溶剂如冷冻丙酮、乙醇、甲醇（改变介电特性）；盐如硫酸铵或硫酸钠（回收蛋白质），非离子聚合物如聚乙二醇（PEG）、聚电解质和蛋白质结合染料。

• 萃取通常应用于大规模发酵，用于浓缩和纯化。产物的溶液和极性在选择萃取溶剂中起主要作用。

• 多级萃取或逆流萃取也以高萃取率应用。混合沉降器、色谱柱和离心萃取器通常用于萃取。用于萃取的溶剂价格昂贵。因此，所有溶剂都在萃取过程中回收和再循环。

纯化

通过浓缩获得的粗产品然后通过分级沉淀、结晶和色谱技术纯化。

• 结晶特别用于回收酸、溶剂以及纯化各种化合物。通过结晶获得的晶体通过过滤分离，溶解在合适的溶剂中，然后重新结晶以确保去除所有杂质。

• 色谱技术通常用于分离和纯化发酵产物。

• 组分分布在固定相和流动相之间。固定相是用合适的溶剂平衡的均匀尺寸颗粒的填充柱，而流动相是在该填充柱中移动的溶剂。

• 待分离的混合物填充到色谱柱中，然后是流动相。吸附色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱、反相色谱和高效液相色谱是常用的蛋白质和药物纯化技术。产品的纯度通过纸层析和薄层层析不断确认。

• 不同类型的纸层析用于检查分离产物的纯度，例如上行纸层析、下行纸层析和圆形纸层析。

制剂

抗生素、蛋白质和酶配制成溶液、悬浮液或干粉。将硫酸铵盐、山梨醇、甘油、PEG等稳定剂添加到这些制剂中。

• 根据剂型，在最终制剂中还添加其他不同的添加剂，例如稀释剂、润滑剂、悬浮剂、乳化剂、着色剂等。

• 干燥是最重要的步骤，主要用于蛋白质产品。接触式干燥器（例如转筒干燥器）、对流式干燥器（例如喷雾干燥器、流化干燥器）和辐射式干燥器（冷冻干燥器）通常用于干燥最终产品。

• 抗生素以粉末或悬浮液的形式包装在无菌小瓶中，用于肠胃外或口服使用。它们可以制成薄膜衣片。

• 在下游加工过程中干燥期间以及过程结束时，需要对发酵产物进行估算。重量分析法、分光光度法、比重法、光密度法、填充细胞体积分数、总活菌数、细胞成分测量、计数室和色谱法是用于估算发酵产物的常用方法。

• 在工艺过程中和最终产品完成时进行发酵产品的质量控制。在下游加工过程中，各步骤的产品评价决定了单元操作的效率。

• 发酵产品的质量保证或质量控制测试包括无菌测试、热原测试、毒性测试、过敏测试、微生物测定和致癌性测试。在上市销售前，它必须满足所有政府标准。

结论

经验证的缩小规模模型可模拟和预测大规模操作，是减轻试点风险并随后以更高效且更经济的方式展示生物过程的有用工具。

许多用于实验室规模分离生物和合成产品的基本技术是由化学家和生物学家发明的，而生物化学和化学工程师的职责是改进这些技术以实现更大的生产能力。

下游加工被视为生物化学工程的一个子领域，而生物化学工程本身又是化学工程的一个子领域。下游加工和分析生物分离都与生物产品的分离或纯化有关，但目的不同。