什么是Cre-Lox重组？

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关键词

基因操作，基因表达，Cre重组酶，识别位点，P1噬菌体，基因组，重组。

引言

Cre-Lox系统是体内进行基因操作的强大工具，因为它可以对基因表达进行出色的时空控制。这在使用动物模型时非常宝贵，因为不受控制的基因表达或完全的基因敲除可能是有害的或致命的。

顾名思义，Cre-Lox系统依赖于两个组件才能发挥作用：Cre重组酶及其识别位点loxP。这些组件已从P1噬菌体中改造用于基因操作。LoxP位点是方向性的34 bp序列，由两个13 bp识别位点组成，并由一个8 bp间隔区隔开。

这些序列除了P1噬菌体外，在任何已知的基因组中都不会自然出现，并且足够长，因此不太可能偶然出现。因此，它们可以用于特定的基因操作，而不会产生意外的副作用。LoxP位点总是成对使用，通常位于基因或感兴趣的区域或报告基因的两侧。loxP位点的方向将决定重组的结果。

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Cre-Lox重组机制

首先，两个Cre蛋白识别loxP位点并与其结合，形成二聚体。两个Cre-loxP二聚体结合在一起形成四聚体，将两个loxP位点以相反的方向结合在一起。最后，在loxP位点的中心发生dsDNA切割，并发生交叉事件。根据loxP位点的方向，重组可能产生三种结果

切除

如果lox位点以相同的方向位于某个序列的两侧，则重组将导致该序列的切除，将其从其原始基因座中删除。此过程基本上是不可逆的。

倒位

如果lox位点以相反的方向位于某个序列的两侧，则重组将导致该序列的倒位。由于lox位点保持不变，因此此过程是可逆的，并且基因可以在两种方向之间无限地“翻转”。

易位

如果lox位点位于不同的DNA片段上，则重组将导致可逆的易位事件。lox侧翼的DNA区域通常被称为“floxed”。

DIO和DO开关

基因的反向版本将不会表达，因此可以使用DIO和DO载体来控制基因表达。DIO和DO载体在其感兴趣的序列的两侧都带有两组不同的lox位点。这些序列可以组合起来构成DIO（双侧翼反向方向）或DO（双侧翼方向）开关。

DIO载体将具有以反向方向克隆的感兴趣基因，并且在存在Cre的情况下将正确定向；因此，DIO载体是“Cre-On”。DO载体将具有以正确方向存在的感兴趣基因，并在存在Cre的情况下发生倒位；因此，它们是“Cre-Off”。

应用

基本的Cre-loxP重组事件对于遗传序列的切除最有用，因为该事件具有不可逆的特性。

Cre依赖性序列敲除

如果某个序列的两侧有两个相同方向的loxP位点，则在存在Cre的情况下，该序列将被切除。这在进行基因编辑实验时非常有用；可以使用选择标记找到成功编辑的克隆，该标记可以使用Cre-Lox稍后去除。但是，对于研究必需基因来说，完全的基因敲除不是一个好选择，因为这将导致致死表型。

Cre依赖性基因表达

可以在基因上游放置一个“lox-stop-lox”盒。在没有Cre的情况下，终止盒会阻止基因的翻译表达。在存在Cre的情况下，终止盒会被删除，基因表达继续进行。但是，使用“lox-stop-lox”方法控制基因表达有一些缺点。当Cre不存在时，此策略具有明显的背景表达水平。此外，终止盒很大，这使得它们难以包装到小的病毒中，例如腺相关病毒（AAV）。

高级应用

光遗传学

DIO载体的一个特别流行的用途是光遗传学实验。视蛋白可以从注入小鼠大脑的DIO AAV表达。小鼠将从细胞类型特异性启动子表达Cre，以便视蛋白仅在某些神经元中表达。当视蛋白在这些神经元中通过光激活时，可以观察到行为变化。

命运图谱实验

DIO开关也可用于命运图谱实验，用于确定某些祖细胞在生物体生长过程中如何复制。在后代细胞中，Cre表达对于报告基因表达不是必需的，因为Cre-On基因修饰是不可逆的且可遗传的。

多个报告基因的共表达

DIO载体对于控制多个报告基因的共表达也非常有用。报告基因载体可以以高摩尔比共转染，同时添加少量表达Cre的载体。这对于绘制某些细胞类型（例如神经元及其突触）非常有用，这些细胞类型难以在高水平的报告基因表达下成像。

研究功能突变

将lox位点放置在不同的位置会导致一个基因的激活和另一个基因的同时切除。该系统可用于轻松地用突变版本替换基因的野生型版本。这是一种研究必需基因的绝佳方法，因为传统的敲除研究将是致命的。

结论

使用Cre-loxp系统的技术提供了研究基因功能的复杂性。最近，为了更精确地控制，Cre-loxp系统一直在不断发展。此外，Cre-loxp系统方法一直在使用Crispr/Cas9技术和病毒系统不断发展。

通过使用更复杂的控制技术，研究人员将能够通过研究特定基因在所需时间（时间）和组织（空间）的功能来了解更精确的基因功能。有用的Cre相关门户网站和数据库将通过允许研究人员查找和获取适合研究的Cre驱动品系来提高研究效率。