什么是荧光染料？

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介绍

荧光染料是光敏化学物质，当吸收光或能量时，电子从基态跃迁到激发态。电子通过各种跃迁返回基态，这些跃迁可能涉及光的量子发射。这种效应称为荧光。发射的光的能量总是低于激发光的能量，因此波长更长。

由于激发光和发射光的颜色不同，因此可以使用光学滤光片将它们彼此分离。荧光染料或荧光团通常用作各种应用中的检测试剂，例如细胞成像和流式细胞术。

诸如荧光显微镜和流式细胞仪等仪器配备有激光器，因此它们可以激发能够吸收特定波长光的荧光染料。已经开发出许多不同的荧光染料，每种荧光染料都具有特定的发射和激发荧光光谱。

荧光染料的发光强度不同。因此，荧光染料的亮度将取决于其吸收光的能力以及吸收光转化为发射光的效率。

荧光染料的特性

荧光染料的重要特性包括其吸收光谱、在方便激发的波长下的消光系数、其发射光谱及其量子效率。荧光染料的特性将取决于其环境。

一些荧光染料，如荧光素，对pH敏感。如果两种荧光染料紧密相关，则可以发生能量转移，其中一种化合物的激发导致另一种化合物发出荧光。为了发生能量转移，受体分子必须具有与供体分子发射光谱重叠的吸收光谱。

荧光染料的类别

一般来说，荧光染料可以分为以下5类。

荧光蛋白

荧光蛋白可以分为两类。第一类由编码其蛋白质结构中荧光的天然蛋白质组成。第二类荧光蛋白是从藻类和植物中发现的藻胆蛋白衍生而来的。

合成小分子

合成分子是一类广泛的相对较小的荧光化合物，在流式细胞术中有着悠久的历史。合成染料可在整个光谱范围内使用，并具有各种配置，这些配置会影响溶解度和细胞通透性。它们也适合进行化学修饰，以通过与脂类、抗体和其他生物分子或配体偶联来进行微调靶向。

量子点

量子点 (QDots) 的使用在 2000 年代后期变得流行。量子点是一种半导体，可以根据粒子的尺寸调整到不同的发射波长。在流式细胞术中，量子点通常由紫外激光激发，尽管它们可以被发射最大值以下的任何光激发，因此在面板中使用时需要仔细计划。

聚合物染料

最近，聚合物染料变得流行起来。随着 Brilliant Violet 的引入，已经开发出用于紫外激发 (Brilliant UV) 和蓝色激发 (Brilliant Blue) 的其他聚合物。聚合物主链本身是荧光的，可以偶联到受体荧光团，形成串联染料。

串联染料

串联染料是一类特殊的荧光分子，利用了 Förster 共振能量转移 (FRET 或荧光共振能量转移)。串联染料非常有用，因为它们可以扩展给定激发激光器的可用光谱。当两个荧光团靠近时。供体分子的发射必须与受体分子的激发重叠。

流式细胞术中的荧光染料

流式细胞术中使用的荧光染料基本上是可以以某种方式附着到生物学上重要的分子上，并且可以通过商业流式细胞仪上常见的激光器激发的荧光染料。这些荧光染料可以附着到抗体或蛋白质上，当与靶标结合时会发出荧光的游离分子，或在各种生物条件下具有其他荧光特性。

用于标记蛋白质的最常见荧光染料是异硫氰酸荧光素，异硫氰酸酯基团与蛋白质中赖氨酸残基上的氨基反应。使用串联染料可以大大扩展可使用的标记蛋白质的数量。例如，PE 和藻胆红蛋白 (APC) 与各种菁染料的缀合物。

荧光染料亮度

在考虑荧光染料时，亮度起着重要的作用。更亮的荧光染料应保留用于低表达的关键标记或罕见事件。虽然在线上有一些资源和图表，其中包含各种荧光染料亮度的选择。随着新型荧光染料的不断开发，紧跟趋势至关重要。据报道，当使用多种聚合物染料进行染色时，它们会聚集，因此在面板中使用它们时，使用推荐的染色缓冲液是一个重要的考虑因素。如果一种荧光染料不起作用，请考虑其可能失败的原因并寻找替代方案。更亮的荧光染料应保留用于关键标记，无论是低表达或未知表达，还是罕见事件。

结论

荧光染料的选择必须考虑染料的亮度、仪器配置和染色方案。随着新型荧光染料的不断开发，紧跟趋势和跨多个供应商的可用选项至关重要，以确保研究人员做出最佳决策，同时不会影响其数据的质量。