限制性内切酶

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什么是限制性内切酶？

限制性内切酶是用于合成重组DNA的生物工具之一。限制性内切酶是从细菌中分离出来的蛋白质。它们识别一个短的、特定的核苷酸序列，并在该特定位点切割DNA，该位点称为限制性位点。当它们识别DNA中的任何特定核苷酸序列时，它们就会水解相邻核苷酸之间的键并切割DNA分子。限制性内切酶通常被称为限制性内切核酸酶，因为它们切割DNA链内部。

限制性内切酶的类型

它们分为三种类型：

• I型 - 这些是复杂的、多亚基酶。它们执行两个功能：限制和修饰。它们在识别位点大约1000个碱基对处切割DNA。因此，它们不用于重组DNA技术，并且由于它们不产生限制性片段，所以几乎没有实际价值。例如：EcoB, EcoK。

• II型 - 这些酶在其识别位点切割DNA，并可在体外用于生产重组分子。它们的识别位点约为4-8个碱基对，并在未甲基化的位点引起切割。它们需要Mg²⁺作为它们的辅因子。目前，已知超过350种不同的II型限制性内切核酸酶具有100种不同的识别序列。例如：EcoRI, BamHI, HindIII。

• III型 - 它们是复杂的酶，兼具限制和甲基化（修饰）的特性。它们在其识别位点25-27个碱基对处切割，因此它们不用于重组DNA技术。例如：EcoPI, HinfIII。

命名法

• 酶的名称来源于分离它们的原核细胞的名称。

• 属的第一个字母成为酶名称的第一个字母。它用大写字母书写。

• 物种名称的前两个字母构成酶名称的第二和第三个字母。它们用小写字母书写。

• 所有这些字母都用斜体书写。

• 酶名称的第四个字母是菌株的第一个字母。它用大写字母书写。

• 从原核细胞的特定菌株中分离酶的顺序由名称末尾的罗马数字表示。

工作机制

每个限制性内切核酸酶都会检查DNA分子，寻找特定的识别序列。一旦找到识别序列，它就会结合到该位点，并通过水解磷酸二酯骨架在特定点切割DNA双螺旋的每两条链。

每个限制性核酸酶的限制性序列由DNA双螺旋中一定数量的特定碱基对组成。它被称为回文核苷酸序列。

限制性内切酶切割DNA链可以产生两种类型的片段：具有粘性末端的片段和具有平末端的片段。

具有粘性末端的片段具有突出部分，因为一个片段比另一个片段长，而平末端在两条链上都有直切。

研究限制性内切酶的重要性

限制性内切酶以高特异性切割碱基对的能力使其在基因工程和分子生物学技术中的广泛应用，使其成为重要的研究对象。

• 分子克隆 - 由于重组分子的合成，限制性内切酶具有极其重要的意义。它们用于切割目的基因和宿主DNA，以便它们可以结合在一起，从而形成重组DNA分子。

• DNA作图 - 限制性内切酶用于确定DNA片段的结构信息。它也称为限制性作图。

• 基因测序 - 限制性内切酶可用于通过消化大的DNA分子然后将其置于测序仪下进行测序。

• 限制性片段长度多态性 - 它涉及消化长DNA序列，然后根据其长度在凝胶电泳上分离它们。这些片段后来转移到含有标记探针的膜上。

• 脉冲场凝胶电泳 - 它涉及分离大的DNA片段，并能够区分不同菌株的细菌。

当前趋势

研究人员进行DNA克隆实验仍然经常采用的一种方法是限制性内切酶消化。如今，研究人员不仅依靠限制性内切酶进行体外实验，还依靠它们进行几乎任何涉及分析、操作和创建新的DNA序列组合的过程。目前，我们可以创建具有几乎任何序列特异性的人工限制性内切酶。

结论

限制性内切酶是一种重要的生物工具，经常用于基因组学。它们用于在特定位点切割DNA分子，并在宿主基因组中创建一个空间以插入目的基因，从而创建重组DNA分子。

常见问题

Q1. 细菌如何对其自身的限制性内切酶具有免疫力？

A1. 细菌使用限制和修饰方法来保护自身的DNA免受限制性内切酶的作用。细菌通过向识别位点添加甲基基团来修饰其限制性位点。

Q2. 解释载体。

A2. 载体包含外源DNA，它是一种将外源DNA转运到宿主细胞的分子载体。载体包含限制性位点（添加DNA）和标记位点以识别转化细胞。

Q3. 哪些因素会影响限制性内切酶的活性？

A3. 为了获得适当的限制性内切酶活性，需要控制的因素包括：

• 星号活性 - 这是限制性内切酶活性的改变，在次优条件下，它们在非特异性位点切割。诱导甲基化DNA的因素：许多DNA分子在其识别位点添加了甲基基团，这使得它们更不容易被特定的限制性内切酶切割。

• 温度 - 大多数内切核酸酶在37摄氏度下最佳工作。但有些内切核酸酶的最佳温度可能低于25度或高于65度。

Q4. 什么是回文序列？

A4. 回文是一组字母，无论正向还是反向阅读都形成相同的单词。类似地，DNA分子中的回文核苷酸序列是指在两条链上（5’到3’）读取相同的碱基对序列，它们位于相反的方向。

5’- GAATTC - 3’

3’- CTTAAG - 5’

Q5. 限制性作图是什么意思？

A5. 限制性作图，也称为基因作图，用于通过将未知片段分解成碎片并识别断点的位置来确定未知片段的序列。通过限制性内切酶分解片段后，它们通过凝胶电泳进行检查，并根据其大小进行分离。